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探讨稀土上转换发光纳米粒子NaYF4: Yb3 +,Er3 + 与

作者:2020-08-27 00:07阅读:文章来源:

  上转换发光纳米材料是一种由低能量的近红外光激发发射出高能量可见光的发光材料,大部分是镧系元素掺杂的上转换纳米粒子。上转换发光材料有很多独特的优点: 毒性小、化学稳定性高、光稳定性好、发射和吸收带狭窄、荧光寿命长,另外由近红外激发发光有较深的光穿透深度、对生物样本和生物组织几乎无损伤、无背景荧光、耐光漂白。这些优异的特性使上转换发光纳米粒子在生物荧光标记染料、药物载体和以能量共振转移为基础的生物检测等医用领域得到广泛的应用。纳米粒子安全高效的进入细胞是这些应用成功实现的关键。然而,关于上转换发光纳米粒子与细胞相互作用的研究尚未见报道。因此,本文对稀土上转换发光纳米粒子与细胞相互作用的机制做了初步的研究。

  上转换发光纳米材料中发光效率最高的是稀土上转换发光纳米粒子,其中的佼佼者是离子对Yb3 + /Er3 + 或Yb3 + /Tm3 + 掺杂的NaYF4纳米粒子。据此,本文选用了两种类型的稀土上转换发光纳米粒子进行研究。第一种是根据文献报道合成的巯基丁二酸修饰的亲水性上转换NaYF4: Yb3 +,Er3 + 纳米粒子( HMNPs) 。第二种是由本课题组合成的氨基修饰的亲水性上转换NaYF4:Yb3 +,Er3 + 纳米粒子( HINPs) 。这两种粒子的物理化学性质相近,但表面电荷极性不同。HMNPs 因表面包覆巯基而带负电,HINPs 因表面接氨基而带正电。HMNPs 是文献报道中比较常用的一种稀土上转换纳米粒子因此很具代表性,而带有正电的HINPs 可以从另一个角度反映上转换发光纳米粒子与细胞的相互作用机制。

  1 实验

  1. 1 试剂和仪器

  高糖培养基( DMEM) ,胎牛血清( FBS) 和0. 25%胰蛋白酶,Gibco; 1% 双抗,磷酸缓冲盐溶液( PBS) ,Hyclone; 曲拉通X-100,Aladdin。GATAN 832. 20B 透射电镜; RF-5301 荧光分光光度计; Zetasizer Nano Seriesa ZEN4602 纳米粒度电位仪; BD FACS Calibur 流式检测仪; LeicaTCS SP8 共聚焦检测仪; Dimension Icon,BrukerAXS 原子力显微镜。

  1. 2 细胞培养

  MDA-MB-231 细胞在完全培养基( 高糖基础培养基∶ 胎牛血清∶ 双抗= 89∶ 10∶ 1) ,37 ℃,5% CO2的条件下培养。

  1. 3 流式细胞检测

  将2 mL 密度为1 × 105 个·mL - 1 的细胞接种在细胞培养皿中培养10 h,然后将培养基吸掉,用PBS 清洗3 次,加入浓度为100 μg·mL - 1 HINPs 或HMNPs 粒子的分散液,分别放在三种不同的培养条件下培养: 37 ℃( 常规条件) ,低温4 ℃和曲拉通X-100 ( Triton X-100) 。

  37 ℃条件下,粒子的分散液是将纳米粒子原液添加到完全培养基制得,用其替换原培养基后放在37 ℃,5% CO2的条件下接着培养。低温4 ℃条件下,将粒子原液加入完全培养基得到分散液,用其替换原培养基放在低温4 ℃的条件下继续培养。曲拉通X-100 条件下,将粒子原液添加到含曲拉通X-100( 体积分数为0. 0033%) 的完全培养基得到分散液,用其替换原培养基放在37 ℃,5%CO2的条件下继续培养。

  每种条件下细胞都分别继续培养1,3,5 和10 h,然后将含粒子的培养基吸出,用PBS 清洗3次,用0. 5 mL 0. 25%的胰酶消化4 min,后用2 mL的完全培养基终止消化,将其放入离心管以1000r·min - 1的速度离心5 min 得到细胞,向离心管内加入3 mL PBS 将细胞吹打均匀后再离心5 min,最后将得到的细胞分散在500 μL 的PBS 中做流式检测。每次至少测量10000 个细胞后再计算细胞平均荧光强度。

  1. 4 共聚焦成像

  将2 mL 密度为2. 5 × 104 个·mL - 1 的细胞悬液接种在含直径为20 mm 玻片的35 mm 的培养皿中培养,培养方式和培养条件与做流式检测的实验相同,不同之处在最后样品处理的过程。细胞在含粒子的培养基中分别培养1,3,5,10 h后,用PBS 清洗3 次,最后向培养皿中加入1 mL 的PBS,接着进行共聚焦检测。

  1. 5 原子力显微镜检测( AFM)

  在研究表面活性剂对上转换纳米粒子与细胞相互作用影响之前,我们先用原子力显微镜做了一些前期实验来研究表面活性剂对细胞形态的影响。培养皿中加入2 mL 密度为3. 25 × 104个·mL - 1的细胞培养10 h。将培养基替换成含有0. 0033% 曲拉通X-100 的完全培养基继续培养10 h。用PBS 将细胞清洗3 次,接着用3% 的甲醛溶液在4 ℃固定2 h,用PBS 清洗5 次,后依次用10%,30%,40%,60%,70%,80%,90% 和100%的乙醇处理5 min 脱水。最后样品用原子力显微镜进行检测。

  2 结果和讨论

  HINPs 和HMNPs 是平均粒径为30 nm 的近似六边形的亲水性稀土上转换发光纳米粒子,HINPs因表面氨基带正电,HMNPs 因表面巯基带负电。稀土上转换发光纳米粒子可以由低能量近红外光激发发射出高能量的可见光,所以进行体内或体外的荧光检测时,可直接使用上转换发光纳米粒子而不需要标记荧光染料。由于没有荧光染料释放到体内环境,所以用这种材料进行荧光成像和流式检测时会获得更准确的数据。虽然HINPs和HMNPs 的表面基团不同,但是浓度相同的HINPs 和HMNPs 溶液由激发光980 nm 激发发射的荧光强度基本相近,所以细胞荧光成像时不会因荧光强度的不同造成巨大的成像差异。HINPs 和HMNPs 在三种不同的培养环境中与细胞相互作用,包括37 ℃( 常规条件) ,低温4 ℃和曲拉通X-100。通过使用共聚焦成像和流式检测两种检测手段对细胞进行表征。

  2. 1 HINPs 与细胞相互作用的探究

  2. 1. 1 37 ℃常规条件

  37 ℃条件下,将细胞放在含有100 μg·mL - 1HINPs 的完全培养基中培养一段时间。由共聚焦图3 可以看到,1 h 时几乎没有HINPs 进入细胞,大部分的颗粒粘附在细胞膜上。3 h 后,大量颗粒进入细胞,使得细胞荧光强度有了显著提高。5 和10h 后,颗粒更加均匀地分布在细胞内,吸附在细胞膜上的颗粒少。随着时间的推移,细胞荧光强度整体上有增加的趋势。通过使用流式细胞仪对细胞荧光强度做定量检测,由图4可知细胞的荧光强度的确随着时间的推移而增长,3 h 内颗粒进入细胞的速度最快,此后粒子进入细胞的数量增长缓慢且逐渐趋于平衡。另外,细胞内有显著的点状荧光分布格局,可以推论HINPs 是被囊泡包裹进入细胞。

  2. 1. 2 低温4 ℃

  4 ℃条件下 4 ℃的条件下基本没有HINPs 进入细胞。根据文献报道在4 ℃的培养条件下为细胞膜转运物质提供能量的途径会受到抑制,从而阻碍胞吞和胞吐等需消耗能量的跨膜运输方式。因此可以推论出细胞对HINPs 的摄取需要消耗能量。

  2. 1. 3 曲拉通X-100

  将细胞在含HINPs 和曲拉通X-100 的完全培养基的条件下培养,进一步探究HINPs 的转运是否与膜蛋白有关。曲拉通X-100 作为一种非离子去污剂,可以破坏蛋白质-脂质以及脂质-脂质之间的连接,但不破坏蛋白质-蛋白质的连接,使蛋白质从细胞膜上溶解和分离。曾有研究表明当曲拉通X-100 的浓度低于0. 15 mmol·L - 1 时,细胞膜的通透性没有变化且不影响细胞活性。为了证明这一点我们先做了预实验,将细胞放在含0. 0033%( 0. 04 mmol·L - 1 ) 曲拉通X-100 的完全培养基中培养10 h,用AFM 进行检测。在没有加曲拉通X-100 的空白对照组中,统计了50 处不同位置不同细胞剖面高度的数值,得出对照组细胞膜的平均高度差为81 nm 。在曲拉通X-100 处理过的实验组中,统计了50 处不同位置不同细胞剖面高度的数值,得出对照组细胞膜的平均高度差为193 nm。实验组的高度差要远大于对照组的高度差,说明曲拉通X-100 确实能在细胞保持活性的情况下使细胞膜产生孔洞。将细胞在含HINPs 与0. 0033% 曲拉通X-100的培养基中培养,细胞内看不到绿色荧光与37 ℃ 条件含HINPs 培养基中培养的细胞相比,在仅是添加了曲拉通X-100 的情况下就导致了细胞内没有绿色荧光的出现,即无纳米粒子的进入。通过前面对曲拉通X-100 作用的讨论可知,虽然细胞膜上出现一些空洞,但细胞仍然保活性、细胞膜的整体构架完整且通透性没有变化,由此可推论出曲拉通X-100 主要影响的是膜蛋白的活性,甚至使得膜蛋白与细胞膜分离。因此HINPs 纳米粒子未能进入细胞,可以理解为由于膜蛋白的失活或缺失而导致纳米粒子不能进入细胞。因此,膜蛋白在HINPs 的跨膜过程中有着非常重要的作用。

  通过对37 ℃,4 ℃和曲拉通X-100 三种条件的实验结果的分析可推出HINPs 进入细胞应该先与细胞膜上的受体蛋白结合,导致膜凹陷,继而形成內吞囊泡进入细胞。这一过程也称为消耗能量的受体介导的胞吞运输方式。

  2. 2 HMNPs 与细胞相互作用的探究

  为了从另一个角度探究上转换纳米粒子与细胞的相互作用,我们采用另一种表面带负电的HMNPs 纳米粒子做相同的实验进行对比。HMNPs与HINPs 细胞荧光强度的变化在总体趋势上没有明显的区别。在37 ℃ 条件下培养时,细胞摄取HMNPs 的量是最大的。在其它情况下基本没有粒子进入细胞。HMNPs 进入细胞的过程同样是一种消耗能量的受体介导的胞吞运输方式。虽然HMNPs 与HINPs 的运输方式相同,但是由共聚焦看到HMNPs 的细胞荧光强度要比HINPs 的细胞荧光强度弱,即HMNPs 进入细胞的量要小于HINPs 的进入量。两种粒子各自相对荧光强度图,计算方法是将每个时间点的实验组与空白对照组的细胞荧光强度相减得到差值,后将每个差值除以1 h 的差值得到相对强度。这样排除了粒子荧光发光强度不同的因素,可以直接定量得出正常条件下细胞对HMNPs 的摄取量的确远低于对HINPs的摄入量,说明带正电的HINPs 更容易和带负电的细胞膜结合进入细胞。

  3 结论

  表面包覆氨基而带正电的HINPs 和包覆巯基带负电的HMNPs 是两种典型的稀土上转换发光纳米粒子。通过研究发现,37 ℃条件下这两种纳米粒子在10 h 内进入细胞的数量呈逐渐增加的趋势,并且呈显著的点状荧光分布。由此表明这些纳米粒子是以囊泡包裹的方式进入细胞的。低温4 ℃时细胞内消耗能量的转运方式受到抑制而此时粒子基本未进入细胞,说明细胞对这些粒子的摄取是消耗能量的过程。适量曲拉通X-100 能在细胞保持活性的状态下使膜蛋白失活甚至脱落,此种条件下也没有粒子进入细胞,证明膜蛋白在纳米粒子的转运中有着重要的作用。综上所述可推断HINPs和HMNPs 的跨膜是一种能量消耗的受体介导的胞吞运输方式。另一方面,带正电的HINPs 相较于带负电的HMNPs 更容易与细胞膜相互作用进入细胞,表明带正电的上转换发光纳米粒子作为运输药物的载体会更有优势。由共聚焦成像和流式检测可知HINPs 在细胞内受激发射出很强的荧光,证明这种材料能够成为优异的体内成像材料。通过对上述研究的分析,我们相信这项工作会为探究上转换发光纳米粒子与细胞相互作用的机制开启新思路,为设计安全高效的纳米药物载体和体内成像材料提供实验和理论依据。

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